Dan uoči eksplozije, 25. travnja 1986. godine vršena su testiranja u nuklearnoj elektrani koja su trebala testirati sigurnost sustava kao i sposobnost turbina da generiraju dovoljne količine električne energije za pokretanje sigurnosnih sustava samog reaktora.
Budući je za rad nuklearnog reaktora RBMK-1000 potrebna voda koja neprestano cirkulira u jezgri dokle god ima nuklearnog goriva, cilj testa je ustvari bio utvrditi mogu li turbine u fazi gašenja proizvesti dovoljno energije da pokrenu vodene pumpe od kojih ovisi rad samog nuklearnog reaktora.

U skladu s tim testiranjem tokokom četvrtka 25. travnja 1986. godine pripremljeni su svi potrebni uvjeti kako bi testiranje moglo početi te se tako počela postupno smanjivati ​​i produkcija električne energije sve do 50% posto mogućnosti reaktora, a zatim se potpuno neočekivano isključila regionalna elektrana koja je to područje opskrbljivala potrebnom električnom energijom. Nakon toga uslijedila je naredba od strane kontrolora u Kijevu da se daljnje postupno smanjivanje odgodi jer je još bila večer te je struja bila potrebna čitavoj regiji. Zahvaljujući toj neželjenoj okolnosti testiranje je odgođeno i povjereno u ruke noćne smjene koja je imala vrlo malo iskustva s radom u nuklearnim elektranama jer je velika većina njih bila dovedena iz elektrana koje su funkcionirale na ugljen.
Oko 23 sata navečer tog dana kontrolor je dao odobrenje za nastavak postupka te je nazivna snaga reaktora od 3.2 GW trebala biti smanjena na 0.7-1.0 GW kako bi se moglo provesti testiranje na donjoj granici snage reaktora. Ali, problem je postojao u činjenici što noćna smjena nije znala da je dnevna smjena već uradila postupno smanjivanje snage reaktora, te su slijedili izvorne smjernice testiranja, a što je prouzročilo prebrzo smanjenje snage reaktora. Oni su vjerovali kako je uzrok brzom opadanju snage reaktora kvar u jednom od automatskih regulatora snage, što je bio potpuno pogrešan zaključak. Prilikom brzog opadanja snage reaktora, reaktor proizvodi više nuklearno otrovnih produkata xenon-135, a koji su uspjeli smanjiti snagu na 30 MW što je otprilike samo 5% one snage koja se testiranjem htjela postići.
Nakon toga, noćna smjena poduzela je sigurnosne mjere u vidu uklanjanja kontrolnih poluga iznad nuklearnog reaktora, ali to nije previše pomoglo jer se snaga reaktora povećala samo do 200 MW, što još uvijek nije predstavljalo ni trećinu minimuma potrebnog za eksperiment. Čak i usprkos toj činjenici noćna smjena je odlučila nastaviti s eksperimentom te su u 01:05 sljedećeg dana bile uključene vodne pumpe koje su trebale biti pogonjene od strane turbina, te tako povećale protok vode iznad dopuštenih sigurnosnih mjera u 01:19. A u točno 01:23:04 započeo je fatalni eksperiment. Na ploči nije bilo nikakvog znaka koji bi upozoravao posadu na opasnost koja im prijeti. Pumpama za vodu je bio prekinut dovod energije, a turbina je bila odvojena od reaktora te se iz tog razloga povećala količina pare u središtu reaktora, a time i temperatura te su se u cijevima počeli stvarati džepovi pare.
Princip rada reaktora RMBK-1000 ima veliki koeficijent ispražnjenja. Koeficijent ispražnjenja je broj koji služi za procjenu koliko se povećava ili smanjuje termalna produktivnost nuklearnog reaktora, au ovom slučaju pozitivni koeficijent ispražnjenja naglo je povećao snagu reaktora budući se smanjila voda koja inače apsorbira neutrone te je u tom stanju reaktor postao vrlo nestabilan i nepredvidljiv. U 01:23:40 operatori su pritisnuli gumb na ploči AZ-5 koje se koristi za isključivanje reaktora u slučaju nužde, a time su također stavljene u rad i manualne kontrolne poluge koje su ranije bile izvađene. No sporost mehanizma umetanja kontrolnih šipki koje traje od 18-20 sekundi te loš dizajn kontrolnih šipki ustvari su postigli suprotni efekt te povećali samu brzinu reakcije. U tom momentu, zbog povećane proizvodnje energije, nastala je deformacija rada mehanizma kontrolnih poluga jer su se kontrolne poluge zaustavile na jednoj trećini punog ciklusa i nisu mogle zaustaviti reakciju. Sedam sekundi kasnije u 01:23:47 snaga reaktora porasla je na 30 GW, odnosno deset puta više od uobičajenoga te su se počele topiti cijevi za gorivo i naglo se povećao pritisak pare, a sve to rezultiralo je ogromnom eksplozijom pare koja je pomaknula i uništila poklopac reaktora težak čak 2.000 tona i napravila ogromnu rupu u krovu. Nakon što je odletio komad krova došlo je do reakcije između kisika iz zraka s vrlo visokim temperaturama reaktora i grafitnog moderatora na krajevima kontrolnih poluga, uzrokujući takozvanu ‘grafitnom vatru’ koja je najviše pridonijela širenju radioaktivnog oblaka na daljnja područja.
Stanje za vrijeme nesreće je bilo veoma loše i to prvenstveno zbog dva faktora: nepripremljenosti na mogućnost nesreće, te pomanjkanja adekvatne opreme, a što je dovelo do mnoštva daljnjih negativnih posljedica i krivih procjena o tome što treba dalje raditi. Stupnjeva radijacije u najžešće pogođenim područjima iznosili su oko 20.000 rendgena po satu, a samo radi usporedbe, smrtonosna doza radijacije iznosi oko 500 rendgena na pet sati. To je rezultiralo činjenicom da su neki nezaštićeni radnici u samo nekoliko minuta zadobili smrtonosne doze radijacije. Negativnu okolnost je predstavljala naročito činjenica da osoblje elektrane nije znalo koliko je radijacija ustvari velika jer je glavni uređaj za mjerenje radijacije stradao prilikom eksplozije, a svi ostali uređaji imali su premalu skalu očitanja radijacije (0.001 R / s) te su pokazivali samo da je stupanj radijacije iznad gornje granice skale. Pore ​​toga, posada elektrane krivo je pretpostavila kako stupanj radijacije iznosi negdje oko 3.6 R / h dok je stvarni stupanj bio oko 5.600 puta veći. Zbog tih lažnih prikaza tada jedino radećih uređaja šef smjene Aleksandar Akimov je procijenio da je reaktor ostao netaknut, te olako ignorirao dokaze u formi komadića grafita i goriva reaktora oko zgrade, a kasnije je čak ignorirao i očitanja novog dozimetra radijacije koji je pokazivao povećani stupanj radijacije tvrdeći kako je riječ o neispravnom uređaju.
Akimov je zajedno s noćnom smjenom ostao do jutra nastojeći napumpati vodu u reaktor, a da pritom nitko od njih nije nosio zaštitno odijelo. Posljedica toga bila je smrt od posljedica radijacije Akimova i svih članova smjene u roku manjem od tri tjedna nakon nesreće. Među žrtvama nije bila samo neiskusna noćna smjena elektrane pošto su u pomoć posadi pristigli i vatrogasci kako su ugasili vatru koja je izbila kao posljedica eksplozije, a kojima nije rečeno da je riječ o eksploziji nuklearnog reaktora, te su oni postupali kao da je riječ o gašenju običnog požara izazvanog strujom. U pet sati ujutro vatrogasci su ugasili požar, no velika većina njih zadobila je smrtonosne doze radijacije, koje su se odmah na licu mjesta manifestirale kao mučnina, vrtoglavica i totalna malaksalost.
Dva dana poslije eksplozije, 27. travnja, reagirala je i sovjetska vlada nakon što se uvjerila u visoki stupanj radijacije te započela tajni plan evakuacije kompletnog stanovništvo okolnog grada Pripyata gdje su bile smještene obitelji zaposlenih u elektrani. Došlo je čak 1.200 autobusa i kamiona koji su formirali kolonu dugu 15 kilometara. Od posljedica radijacije neposredno nakon nesreće stradao je ukupan broj od 29 spasilaca, vatrogasaca i članova ekipe, a oko 350.000 ljudi evakuirano je iz kontaminiranih područja u blizini reaktora. Prema procjenama stručnjaka stupanj radijacije je bio jednak onome od 400 atomskih bombi bačenih na Hiroshimu!
Ekosistem u blizini reaktora također je pretrpio katastrofalne posljedice jer su četiri kvadratna kilometra okolne šume promijenile boju u nijansu ljubičasto-smeđe boje, te su prozvane ‘Crvenom šumom’ – Red Forest, a stradao je i velik broj životinja dok su neke u potpunosti izgubile sposobnost razmnožavanja.